Aspects moléculaires des effets des radiations ultraviolettes et ionisantes sur l'ADN cellulaire

A propos des auteurs [1]

.

Plusieurs expériences en orbite spatiale ont montré que le rayonnement cosmique (consistant principalement de photons très énergétiques, de protons et d’ions multichargés) en l’absence de lumière solaire du vide (protection assurée par l’interposition d’une membrane de mylar par exemple) induit divers effets biologiques. On ainsi peut citer la mise en évidence d’effets létaux et mutagènes du rayonnement cosmique dans des échantillons biologiques divers tels que le bactériophage T4, les graines de maïs et d’Arabidopsis. Ces informations ont été complétées par des résultats obtenus lors d’expériences au sol à l’aide d’accélérateurs de particules [pour des articles de revues sur l’inactivation cellulaire et la mutagenèse induites par les ions lourds, voir 3-6]. Il est intéressant de signaler que l’induction de mutations a été observée non seulement dans des spores bactériennes mais aussi dans des cultures cellulaires d’E. coli, de levures, de mammifères et de Drosophile. Il a été aussi montré qu’il existe une corrélation étroite entre la distribution des mutations dans le locus hprt de cellules humaines et la valeur du transfert d’énergie linéique (TEL) des particules chargées [7]. Il est aussi établi que les particules multichargées représentent la composante la plus importante du rayonnement cosmique en termes d’effets biologiques potentiels pour un cosmonaute au cours d’un vol orbital [8]. On peut ajouter qu’il existe désormais un consensus sur le fait que l’ADN est la principale cible cellulaire des effets biologiques (létalité cellulaire, mutagenèse, cancérogenèse) des rayonnements ultraviolets et ionisants. Il est toutefois clair qu’une atteinte chimique de protéines fonctionnelles (enzymes) et de lipides instaurés membranaires peut aussi affecter la survie cellulaire.

1 – Modifications photo-induites de l’ADN

Les principales réactions de dégradation de l’ADN cellulaire induites par les diverses composantes du rayonnement solaire sont en grande partie connues [pour des revues, voir 9-11]. Ainsi les bases pyrimidiques adjacentes (thymine et cytosine) sont les sites les plus réactifs de l’excitation de l’ADN par des photons UVC et UVB. Deux réactions principales ont été mises en évidence, la plus importante étant globalement une cycloaddition [2+2] qui conduit à la formation de dimères pyrimidiques cyclobutyle (Pyr<>Pyr). La deuxième réaction fait intervenir une cycloaddition de type Paterno-Büchi conduisant à la formation d’adduits pyrimidine (6-4) pyrimidone (6-4PP) par l’intermédiaire d’un dioxétanne ou d’une azétidine instable. L’importance de ces deux réactions compétitives dépend étroitement de la séquence de l’ADN, les photoproduits Pyr<>Pyr et 6-4PP étant globalement plus importants aux sites thymine-thymine et thymine-cytosine qu’aux deux autres enchaînements bipyrimidiques (cytosine-thymine et cytosine-cytosine). On peut ajouter que les adduits 6-4PP sont susceptibles d’être convertis en leurs isomères de valence Dewar par l’absorption de photons UVA (320 nm < lambda < 360 nm) dans l’ADN cellulaire [12]. Il a été aussi montré que la déshydratation du contenu cellulaire des spores bactériennes favorise la formation d’un autre composé dimérique de la thymine à savoir la 5,6-dihydro-5-(alpha-thyminyle)thymine, appelée communément le photoproduit des spores et cela au détriment des dimères cyclobutyle et des adduits 6-4PP. La présence dans l’ADN de spores bactériennes de petites protéines acido-solubles complexantes favorise aussi la formation du photoproduit des spores [13]. Il est intéressant de noter que ce dernier photoproduit peut être réparé efficacement lors de la germination des spores par des lyases spécifiques. Il existe aussi dans le monde bactérien des photolyases dédiées à la photoreversion des deux grandes catégories de photoproduits dimériques que sont les Pyr<>Pyr et 6-4PP [12]. D’autres systèmes de réparation de ces derniers dommages qui font intervenir des mécanismes d’excision de bases ou de nucléotides dans l’étape initiale sont aussi présents dans le monde vivant afin de préserver l’intégrité du patrimoine génétique. On peut ajouter que le rayonnement UVA qui est la composante la moins énergétique de la lumière UV est capable d’engendrer la formation de Pyr<>Pyr par un mécanisme de transfert d’énergie triplet faisant intervenir des agents de photosensibilisation endogènes. Toutefois l’importance de ce processus est probablement très faible par rapport à la contribution majoritaire du rayonnement UVC dans la formation de photoproduits de l’ADN après exposition à la lumière solaire du vide. L’absence d’atmosphère et plus particulièrement d’oxygène dans le vide spatial a pour conséquence la prévention des réactions de photosensibilisation oxydative qui impliquent sur terre la formation d’oxygène singulet et de radical superoxyde par des mécanismes de transfert d’énergie et de transfert de charge respectivement [14].

Notre laboratoire est actuellement impliqué avec plusieurs groupes européens dans le cadre d’un programme spatial soutenu par l’ESA dans la recherche des principaux photoproduits susceptibles de se former dans l’ADN de divers types de micro-organismes après une exposition au rayonnement solaire du vide. On peut mentionner que nous ne disposions jusqu’à récemment que d’informations partielles concernant la formation des dommages photo-induits par les composantes UVC et UVB dans l’ADN (Pyr<>Pyr, 6-4PP et leurs isomères de valence Dewar) avaient été effectuées essentiellement par des méthodes peu spécifiques reposant sur des approches immunologiques. Les réponses ainsi obtenues qui n’étaient que semi-quantitatives ne permettaient pas la mesure individuelle des photolésions pyrimidiques. Cette imprécision est désormais levée par la mise au point d’une nouvelle méthode qui implique l’association d’une analyse par chromatographie haute performance à une détection par spectrométrie de masse en mode tandem (CLHP-SM/SM). Ainsi dans une première étape les trois catégories de photoproduits dimériques de la base thymine ont été quantifiées dans l’ADN cellulaire [15]. L’application de cette méthode très performante a été étendue à la mesure des photoproduits formés dans les trois autres sites dipyrimidiques de l’ADN (cytosine-thymine, thymine-cytosine et cytosine-cytosine) [16] et du photoproduit des spores [17,18] permettant désormais d’établir un bilan complet de la formation des photoproduits dimériques dans l’ADN cellulaire. La mesure du niveau des différents photoproduits dans l’ADN de spores devrait permettre d’évaluer le rôle protecteur éventuel de micrométéorites sur ces microorganismes lors de l’exposition au rayonnement solaire du vide.

2 – Modifications radio-induites de l’ADN

Les processus primaires résultant de l’interaction du rayonnement cosmique avec l’ADN cellulaire impliquent principalement ’excitation et l’ionisation de la molécule irradiée par effet direct. De récentes études théoriques faisant appel à des méthodes Monte-Carlo font apparaître que la contribution de la radiolyse des molécules d’eau situées dans l’environnement immédiat de l’ADN (effet quasi-direct) diminue avec la valeur de transfert d’énergie linéique de la particule considérée. Il faut aussi considérer le rôle des électrons secondaires qui, après leur éjection de la molécule cible, peuvent réagir dans les zones proches du lieu de l’ionisation (les bases pyrimidiques et, à un degré moindre, les bases puriques montrent une excellente affinité pour les électrons ainsi libérés). Il faut ajouter les effets indirects générés par les particules chargées qui font intervenir la radiolyse de l’eau avec libération d’espèces réactives comme le radical hydroxyle, l’atome d’hydrogène et l’électron solvaté. Les estimations de la dimension de la trace d’un ion lourd au niveau de l’impact ont permis de définir le volume critique impliqué dans le dépôt d’énergie. Celui-ci apparaît être supérieur à la taille de l’ADN [19] ce qui devrait conduire, pour les raisons évoquées ci-dessus, à la génération de lésions multiples [20,21] qui pourraient prendre la forme d’une cassure double brin, de deux bases modifiées relativement proches ou d’une cassure simple brin dans le voisinage d’une modification d’une base sur le même brin ou sur le brin complémentaire. Malheureusement nous ne disposons actuellement que de peu d’informations sur la nature de ces modifications radio-induites, à l’exception des cassures doubles de l’ADN [22] qui, il faut le noter, représentent une classe de dommages hétérogène. On peut noter que quelques estimations récentes ont été effectuées sur des dommages complexes impliquant des bases modifiées [23,24].

En fait on dispose de données plus abondantes sur la formation de dommages radio-induits de bases qui peuvent être formés par action du radical hydroxyle (effet indirect) et de l’arrachement d’un électron à une base pyrimidique ou purique. Ces réactions conduisent à la formation de plusieurs catégories de lésions qui incluent des dommages des bases puriques et pyrimidiques, des cassures simples de l’ADN, des sites abasiques, des pontages ADN-protéines et des adduits de bases aminées avec des aldéhydes provenant de dérivés d’oxydation du 2-désoxyribose et/ou de la décomposition de peroxydes lipidiques. La détermination des mécanismes d’altération de l’ADN implique l’étude de systèmes modèles (nucléosides, courts oligonucléotides). Ces travaux reposent sur l’attribution structurale des produits de modification et les informations cinétiques et chimiques concernant les espèces radicalaires impliquées dans ces réactions. Des données complémentaires, en particulier sur la réactivité de ces dernières espèces, peuvent être aussi obtenues par des approches théoriques. On peut rappeler que le radical superoxyde et le peroxyde d’hydrogène ne présentent pas de réactivité détectable pour les divers constituants de l’ADN. Par contre la réaction du radical OH avec le 2-désoxyribose conduit à la formation de cassures de chaînes d’ADN par arrachement d’un atome d’hydrogène ; on note aussi la production d’environ 70 modifications des bases puriques et pyrimidiques en incluant la 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoGua) généralement utilisée comme un marqueur biologique d’exposition aux agents oxydants. Il est intéressant de noter que la lésion 8-oxoGua peut-être aussi engendrée par l’action d’agents d’oxydation à un électron, du peroxynitrite et de l’oxygène singulet (1/O2) en faisant intervenir des mécanismes différents. On peut conclure que des mécanismes relativement complets des modes d’oxydation de l’ADN isolé et de ses constituants sont disponibles pour le radical •OH et pour les réactions de transformation des radicaux cations pyrimidiques et puriques [pour des revues récentes, voir références 25-28].

Ces travaux sous-tendent des études à finalité plus biochimique avec la recherche de ces mêmes dommages dans l’ADN cellulaire, permettant aussi de valider les résultats des études mécanistiques effectuées sur des composés modèles. Pour cela, la mise au point de diverses méthodes chimiques et biochimiques sensibles et spécifiques (le niveau de détection requis est de 1 modification pour 10^6 à 10^7 nucléosides normaux dans un échantillon d’ADN de quelques µg) a été effectuée [29]. Plusieurs bases puriques et pyrimidiques oxydées ont été mesurées avec des sensibilités de détection de l’ordre de quelques femtomoles en mettant en œuvre la technique de chromatographie liquide associée à une détection par spectrométrie de masse en mode tandem qui a aussi bénéficié de méthodes optimisées d’extraction de l’ADN [30,31]. Ceci permet d’obtenir des informations sur la nature et l’importance quantitative de réactions d’oxydation de l’ADN dans l’environnement cellulaire par des agents endommageant d’origine endogène et exogène. Ainsi les principaux produits d’oxydation des bases puriques et pyrimidiques de l’ADN ont été mesurés individuellement par CLHP-SM/SM après exposition à des radiations ionisantes (rayonnement gamma, particules chargées) [32]. On peut ajouter que la technique modifiée des comètes en version alcaline qui implique l’utilisation d’enzymes de réparation (ADN N-glycosylases) pour détecter la présence de bases modifiées est très adaptée à la mesure de faibles valeurs de formation de lésions. A titre d’exemple il est a été possible de détecter la présence de dommages radio-induits de bases puriques et pyrimidiques dans de l’ADN de cellules humaines après exposition à des doses de rayonnement ionisant aussi faibles que 0,1 Gy [33]. Ces travaux sont complétés par des études de spécificité d’enzymes de réparation en utilisant des oligonucléotides modifiés dans lesquels une lésion a été spécifiquement insérée par synthèse chimique. Ces mêmes fragments d’ADN modifiés ont été utilisés pour des études de réplication et de mutagenèse [28].

• [1] Horneck G (2000) Quantification of biologically effective environmental UV irradiaance. Adv Space Res, 26 : 1983-1994.
• [2] Rettberg, P, Eschweiler U, Strauch K, Reitz G ; Horneck G, Wanke H, Brack A, Barbier B (2002) Survival of microorganisms in space protected by meteorite material : results of the experiment ’EXOBIOLOGIE’ of the PERSEUS mission. Adv Space Res, 30 : 1539-1545.
• [3] Blakely EA (1992) Cell inactivation by heavy charged particles. Radiat Environ Biophys, 31 : 181-196.
• [4] Kiefer J (1992) Heavy ions on cells : chromosomal aberrations, mutations and neoplastic transformation. Radiat Environ Biophys, 31:279-288.
• [5] Lett JT (1992) Damage to cellular DNA from particulate radiations ; the efficay of its processing and the radiosensitivity of mammalian cells. Emphasis on double strand breaks and chromatin breaks. Radiat Environ Biophys, 31:257-277.
• [6] Horneck G, Krasavin EA, Kozubeck S (1994) Mutagenic effects of heavy ions in bacteria. Adv Space Res, 14 : 315-329.
• [7] Whaley JM, Little JB (1990) Molecular characterization of hprt mutants induced by low- and high-LET radiations in human cells. Mutat Res, 243 : 35-45.
• [8] Schimmerling W, Cucinotta FA, Wilson JW (2003) Radiation risk and human space exploration. Adv Space Res, 31 : 27-34.
• [9] Cadet J, Vigny P (1990) The Photochemistry of Nucleic Acids. Dans : Biorganic photochemistry : Photochemistry and the Nucleic Acids (H Morrison, Ed) John Wiley, New York, pp 1-272.
• [10] Cadet J, Sage E, Douki T (2005). Ultraviolet radiation-mediated damage to cellular DNA. Mutat Res, 571 : 3-17 (2005).
• [11] Cadet J, Courdavault S, Ravanat J-L, Douki, T (2005) UVB and UVA radiation-induced damage to isolated and cellular DNA. Pure Appl Chem, 77 : 947-961.
• [12] Courdavault S, Baudoin C, Charveron M, Canguilhem B, Favier A, Cadet J, Douki T (2005) Repair of the three main types of bipyrimidine DNA photoproducts in human keratinocytes exposed to UVB and UVA radiations. DNA Repair, 4 : 836-844.
• [13] Douki T, Setlow B, Setlow K (2005) Effects of the binding of alpha-beta-type small, acid-soluble spore proteins on the photochemistry of DNA in spores of Bacillus subtilis and in vitro. Photochem Photobiol, 81 : 163-169.
• [14] Courdavault S, Baudoin C, Charveron M, Favier A, Cadet J, Douki T (2004) Larger yield of cyclobutane dimers than 8-oxo-7,8-dihydroguanine in the DNA of UVA-irradiated human skin cells. Mutat Res, 556 : 135-142.
• [15] Douki T, Court M, Sauvaigo S, Odin F, Cadet J (2000) Formation of the main UV-induced thymine dimeric lesions within isolated and cellular DNA as measured by high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J Biol Chem, 275 : 11678-11685.
• [16] Douki T, Cadet J (2001) Individual determination of the yield of the main UV-induced dimeric pyrimidine photoproducts in DNA suggests a high mutagenicity of CC photolesions. Biochemistry, 40 : 2495-2501.
• [17] Douki T, Cadet J (2003) Formation of the spore photoproduct and other dimeric lesions between adjacent pyrimidines in UVC-irradiated dry DNA. Photochem Photobiol Sci, 2 : 433-436.
• [18] Douki T, Laporte G, Cadet J (2003) Inter-strand photoproducts are produced in high yield within A-DNA exposed to UVC radiation. Nucleic Acids Res, 31 : 3134-3142.
• [19] Michalik V (1993) Energy deposition clusters in nanometer regions of charge particle-tracks. Radiat Res, 134 : 265-270.
• [20] Nikjoo H, O’Neill P, Wilson WE, Goodhead DT (2001) Computational approach for determining the spectrum of DNA damage induced by ionizing radiation. Radiat Res, 156 : 577-583.
• [21] Ward JF, Mullingan JR (1997) Four mechanisms for the production of complex damage. Radiat Res, 148 : 481-522.
• [22] Testard I, Sabatier L (2000) Assessment of DNA damage induced by high-LET ions in human lymphocytes using the comet assay. Mutat Res, 448 : 105-115.
• [23] Gulston M, Fulford J, Jenner T, de Lara C, O’Neill P (2002) Clustered DNA damage induced by gamma radiation in human fibroblasts (HF19), hamster (V79-4) and plasmid DNA is revealed as Fpg and Nth sensitive sites. Nucleic Acids Res, 30 : 3464-3472.
• [24] Sutherland BM, Georgakilas G, Bennett PV, Laval J, Sutherland JC (2003) Quantifying clustered DNA damage induction and repair by gel electrophoresis, electronic imaging and number average length analysis. Mutat Res, 531 : 93-107.
• [25] Burrows CJ, Muller JG (1998). Oxidative nucleobase modifications leading to strand scission. Chem Rev, 98 : 1109-1152.
• [26] von Sonntag C (1987). The Chemical Basis of Radiation Biology. Taylor Francis, London.
• [27] Cadet J, Douki T, Gasparutto D, Ravanat J-L (2003) Oxidative damage to DNA : Formation, measurement and biochemical features. Mutat Res, 531 : 5-23.
• [28] Cadet J, Douki T, Gasparutto D, Ravanat J-L (2005) Réactions d’oxydation et cibles biologiques : acides nucléiques. Dans Radicaux Libres et Stress Oxydant : Aspects Biologiques et Pathologiques (J Delattre, J-L Beaudeux, D. Bonnefont-Rousselor, Eds) Edition Tec Doc Lavoisier, Paris, Chapitre 7, pp 169-243.
• [29] Cadet J, Douki T, Frelon S, Sauvaigo S, Pouget J, Ravanat J (2002). Assessment of oxidative base damage to isolated and cellular DNA by HPLC-MS/MS measurement. Free Radic Biol Med, 33 : 441-449.
• [30] Ravanat J-L, Douki T, Duez P, Gremaud E, Herberet K, Hofer T, Lasserre L, Saint-Pierre C, Favier A, Cadet J (2002). Cellular background level of 8-oxo-7,8-dihydro-2’-deoxyguanosine : an isotope based method to evaluate artefactual oxidation of DNA during its extraction and subsequent work-up. Carcinogenesis, 23 : 1911-1918.
• [31] Collins AR, Cadet J, Möller L, Poulsen HE, Viña J (2004). Are we sure we know how to measure 8-oxo-7,8-dihydroguanine in DNA from human cells, Arch Biochem Biophys, 423 : 57-65.
• [32] Pouget JP, Frelon S, Ravanat JL, Testard I, Odin F, Cadet J (2002). Formation of modified DNA bases in cells exposed either to gamma radiation or to high-LET particles. Radiat Res, 157 : 589-595.
• [33] Sauvaigo S, Petec-Calin C, Caillat S, Odin F, Cadet J (2002). Comet assay coupled to repair enzymes for the detection of oxidative damage to DNA induced by low doses of gamma-radiation : use of YOYO-1, low-background slides, and optimized electrophoresis conditions. Anal Biochem, 303 : 107-109.

.